烯还原酶


α,β-不饱和羰基化合物在制药、农药和材料等多个领域具有重要的作用。在预先构建的分子框架中直接脱氢引入与羰基相邻的C=C双键是构建α,β-不饱和羰基化合物的理想策略之一。近几十年来，合成化学家发展了许多催化体系来实现此过程。例如羰基α位卤化-消除的串联过程；Saegusa-Ito氧化；高价碘氧化；新型氧化剂 (SeO₂、N-叔丁基苯基亚磺酰亚胺氯、IBX和AZADO等) 介导的直接脱氢；过渡金属催化；电催化等。然而，目前已有的方法要么需要多步合成，要么需要在较强氧化性条件下进行，或使用较高当量的金属催化剂。更重要的是，目前还没有一个普适的催化体系，可以在去饱和化过程中实现立体化学的精确控制。这些局限都限制了直接脱氢去饱和化反应在合成化学中更广泛的应用。

近年来，酶催化剂因其选择性控制精确、易于改造进化和绿色环保等独特优势，越来越受到合成化学家的关注。自然界中存在一些天然催化羰基去饱和化反应的酶，但它们的底物普适性差，难以作为催化剂被广泛应用。为了克服这些局限，西湖大学叶宇轩课题组从一类底物范围好、热稳定性高、易于表达的烯还原酶出发，成功把其从还原酶改造成去饱和化酶，建立了一个通用的酶催化羰基去饱和化反应平台，合成了一系列含有远端四级手性中心的高价值环己烯酮产物。此酶催化反应体系条件温和、操作简单、易于放大，展现出与已有的化学合成方法互补的反应性和选择性。相关成果发表于Nature Chemistry上。

作者首先建立了结构多样的烯还原酶库，以4-甲基-4-苯基-环己酮作为模型底物，在氧气存在的条件下对ERED的脱氢反应性进行评估，发现CrS和GkOYE表现出较好的活性和对映选择性控制。当温度升高时，去饱和化反应性提高。随后作者以野生型CrS和GkOYE为起点，利用定向进化技术提高酶催化剂的反应效率。单突变体CrS1 (Y27L)、CrS2 (Y27C) 和CrS3 (Y27T) 分别以79% (98:2 er), 88% (98:2 er)和81% (97:2 er) 得到烯酮产物；GkOYE-WT经过三轮进化得到一个三重突变体GkOYE3 (D73G、C26S、Y28V)，可以以很高的效率催化去饱和化产物的生成 (96%，>99:1 er)。在此基础上，作者收集了在定向进化中获得的有益突变体，对含有多种取代基的环己烯酮底物进行了底物兼容性考察，共55个底物在这一生物催化平台下大多能以较高的产率和高水平的对映选择性得到产物。此外，该方法能够放大至克级规模并且不损失对映选择性。并且这一创新的催化方法可以应用于(+)-Mesembrine不对称合成中的关键手性中心构建。通过酶促去饱和化过程制备的环己烯酮产物能够高立体特异性的转化为有价值的羰基转位产物，或是经历底物控制的非对映选择性Diel-Alder反应，生成了带有三个相邻立体中心的六氢萘酮。

图1. GkOYE和CrS作为去对称去饱和化酶的反应发现和定向进化。a，在研究了一组EREDs并优化了反应条件后，GkOYE和CrS是用于该反应的两种最佳酶；b，一轮ISM产生CrS变体，以高产率和高水平的对映选择性催化去饱和。三轮ISM得到的GkOYE3，以96%的收率提供了所需的产物2，> 99:1

最后，作者对这一反应的机理进行了探索。此脱氢反应的可能机理是: 底物在酶的活性空腔结合后，保守的酪氨酸残基阴离子 (GkOYE3的Y169) 对底物进行α-去质子化，形成烯醇中间体Int1。随后，一种反应机理是经历路径A，Int1将β-氢负转移至FMN_ox，得到去饱和化的烯酮产物和FMN_hq。此反应途径与ERED催化的天然还原过程相反，符合微观可逆性原理。另外一种反应机理是经历路径B，Int1与FMN_ox进行单电子转移 (SET)，生成相应的α-酰基中间体Int2和黄素半醌FMN_sq，然后进行质子转移 (PT) 和另一个单电子转移 (SET) 成烯酮产物和FMN_hq。此反应途径与近期报道的ERED催化的单电子氧化反应类似。最后，在酶催化剂释放产物，FMN_hq与空气中的分子氧发生反应，经历黄素氢过氧化物中间体，形成过氧化氢并重新生成氧化态辅因子FMN_ox。

基于这个机理模型，作者首先利用氢氘交换实验和基因敲除实验证明了Y169氨基酸残基对去饱和化反应的重要作用。自由基钟实验结果与β-氢负转移机制一致。接着，作者对该反应独特的β-氢负转移步骤进行了动力学研究，证明了反应的决速步是β-氢负转移。α-和β-位的动力学同位素效应 (KIE) 与所提出的α-去质子化和β-氢负转移的反应途径一致。动力学实验表明，定向进化后的突变体GkOYE3的催化去饱和化半反应速度比GkOYE-WT快约57倍，还原反应速度变慢约0.7倍，与氧反应速度比GkOYE-WT快约1.5倍。总体而言定向进化产生的突变体在所有三个关键基元步骤中都更适合去饱和化。

图2. a 该酶促反应可以以高产率和优异的对映选择性水平放大纸克级规模。照片中展示的是克级反应装置；b (+)-Mesembrine的有效制备。关键的去饱和化步骤步骤以86%和83%的克级产率(> 99:1 er)实现；c 通过酶去饱和作用获得的产物进一步衍生为具有高水平对映体特异性的有价值的复杂分子

叶宇轩课题组成功的解锁了烯还原酶的全新非天然去饱和化反应性，把它们从还原酶改造成为了去饱和化酶。此创新生物催化去饱和化平台展现出与已有方法互补的反应性和优越的选择性，具有较好应用潜力。作者通过系统的机理研究，加深对酶催化去饱和化机理的理解，为此反应体系的进一步发展奠定了基础。

图3. 去饱和化底物范围

论文地址：https://www.nature.com/articles/s41557-024-01671-1